近年来，免疫细胞在抗肿瘤、抗病毒和抗衰老的临床研究与转化中备受关注，尤其在肿瘤生物治疗领域取得了显著进展。
在进行免疫细胞与化疗联用时，通常在化疗前先采血，待化疗后 7 - 15 天左右再进行回输，以确保免疫细胞治疗的效果。
极个别情况下，为防止后续无法满足采血条件，外周血来源 NK 细胞需短期冻存，以备下次使用；而脐带血来源的免疫细胞作为 “现货” 型，长期处于低温冻存状态。
那么，问题来了，经过低温冻存的免疫细胞在多长时间内才不会影响其功能和活性呢？实际上，外周血和脐带血来源的情况存在显著差异。
接下来，以 NK 细胞为例，具体探讨外周血来源和脐带血来源的 NK 细胞经过低温冻存前后细胞表型及功能的变化，为大家解开疑惑。
一项 “-80℃短期冻存对 NK 细胞功能及杀伤活性的实验研究” 报道，探讨了 -80℃短期冻存不同时间对 NK 细胞及杀伤活性的影响。
研究人员采集和分离健康人外周血单个核细胞，在体外培养扩增细胞，扩增 12 天后将部分 NK 细胞于 -80℃冻存 1/4/12/24 周。
通过流式细胞仪分析冻存不同时间的 NK 细胞的表型、凋亡百分率、颗粒酶 B、穿孔素及 CD107a 表达。如图所示，-80℃冻存 24 周的 NK 细胞与未冻存的 NK 细胞的表型、活性、颗粒酶 B、穿孔素及 CDl07a 表达相比，差异有统计学意义 (P < 0.05)。而 -80℃冻存 12 周内的 NK 细胞与未冻存的 NK 细胞各组相比，差异无统计学意义 (P > 0.05)。
研究人员进一步研究冻存不同时间的 NK 细胞对食管癌细胞株杀伤活性的影响。取冻存前后的 NK 细胞作为效应细胞，复苏的食管癌细胞为靶细胞，在效靶比为 10：1 时未冻存的 NK 细胞与冻存 1、4、12、24 周的 NK 细胞的杀伤活性分别为 63.78％、62.03％、61.87％、60.94％、52.67％。冻存 24 周的 NK 细胞与未冻存 NK 细胞的杀伤活性比较，差异有统计学意义 (P < 0.05)。
研究表明，-80℃冻存 12 周以内的 NK 细胞与未冻存的 NK 细胞比较，在表型和凋亡百分率方面均无明显变化，且细胞功能及杀伤活性也无明显改变，而肿瘤患者化疗的一个疗程大约为 4 周，因此 -80℃冻存细胞可以满足大多数患者的需求。
二、脐带血来源的 NK 细胞冷冻 10 年，扩增能力和效应功能没有影响
此外，扩增的 CB - NK 细胞显示出对来自三阴性乳腺癌和雌激素受体阳性 / 孕激素受体阳性乳腺癌患者的原发性乳腺癌细胞的细胞毒性。
研究表明，长期冷冻保存对扩增的脐带血来源 NK 细胞的扩增潜力或效应功能没有影响，长期冷冻保存的 CB 在临床上仍然可用于治疗性 NK 细胞的离体扩增。
肿瘤免疫细胞治疗正迅速发展，未来免疫细胞的用途将越来越广泛，健康的免疫细胞是培养扩增的必要条件，因此来源不断拓宽，不仅局限于外周血，脐带血中同样含有丰富的免疫细胞。
脐带血 NK 细胞来源广、易采集、免疫原性低、组织相容性好，细胞较原始状态，增殖能力更强，靶向杀伤癌细胞的效率也更高。
脐带血来源的 NK 细胞收集和冷冻保存更加便捷，长期冷冻保存对脐带血 NK 细胞的扩增潜能和抗肿瘤活性均无影响。而外周血 NK 细胞在短期（12 周内）冻存无影响，局限性较大。
患者可灵活选择在合适时间内复苏 NK 细胞进行回输，保障患者的疗效，为肿瘤患者争取更多的免疫细胞治疗机会。
参考文献：
1.-80℃短期冻存对NK细胞功能及杀伤活性的实验研究.徐州医科大学学报.2018
2.Ex Vivo-expanded Natural Killer Cells Derived From Longterm Cryopreserved Cord Blood are Cytotoxic Against Primary Breast Cancer Cells.Journal of immunotherapy.2018
在进行免疫细胞与化疗联用时，通常在化疗前先采血，待化疗后 7 - 15 天左右再进行回输，以确保免疫细胞治疗的效果。
极个别情况下，为防止后续无法满足采血条件，外周血来源 NK 细胞需短期冻存，以备下次使用；而脐带血来源的免疫细胞作为 “现货” 型，长期处于低温冻存状态。
那么，问题来了，经过低温冻存的免疫细胞在多长时间内才不会影响其功能和活性呢？实际上，外周血和脐带血来源的情况存在显著差异。
接下来，以 NK 细胞为例，具体探讨外周血来源和脐带血来源的 NK 细胞经过低温冻存前后细胞表型及功能的变化，为大家解开疑惑。
一、外周血来源 NK 细胞 -80℃短期冻存12 周内 NK 细胞活性无明显变化
一项 “-80℃短期冻存对 NK 细胞功能及杀伤活性的实验研究” 报道，探讨了 -80℃短期冻存不同时间对 NK 细胞及杀伤活性的影响。
通过流式细胞仪分析冻存不同时间的 NK 细胞的表型、凋亡百分率、颗粒酶 B、穿孔素及 CD107a 表达。如图所示，-80℃冻存 24 周的 NK 细胞与未冻存的 NK 细胞的表型、活性、颗粒酶 B、穿孔素及 CDl07a 表达相比，差异有统计学意义 (P < 0.05)。而 -80℃冻存 12 周内的 NK 细胞与未冻存的 NK 细胞各组相比，差异无统计学意义 (P > 0.05)。
研究人员进一步研究冻存不同时间的 NK 细胞对食管癌细胞株杀伤活性的影响。取冻存前后的 NK 细胞作为效应细胞，复苏的食管癌细胞为靶细胞，在效靶比为 10：1 时未冻存的 NK 细胞与冻存 1、4、12、24 周的 NK 细胞的杀伤活性分别为 63.78％、62.03％、61.87％、60.94％、52.67％。冻存 24 周的 NK 细胞与未冻存 NK 细胞的杀伤活性比较，差异有统计学意义 (P < 0.05)。
研究表明，-80℃冻存 12 周以内的 NK 细胞与未冻存的 NK 细胞比较，在表型和凋亡百分率方面均无明显变化，且细胞功能及杀伤活性也无明显改变，而肿瘤患者化疗的一个疗程大约为 4 周，因此 -80℃冻存细胞可以满足大多数患者的需求。
二、脐带血来源的 NK 细胞冷冻 10 年，扩增能力和效应功能没有影响
脐带血中 NK 细胞含量丰富，所占比例是外周血的 3 倍，是 NK 细胞很有前途且无创的来源。脐带血往往需要长期冷冻，那么其用于 NK 细胞体外扩增是否还具有活性呢？一项发表在《J Immunother》杂志上的研究表明，长期深低温保存的 NK 细胞并不影响其扩增能力和抗肿瘤活性。
研究人员从脐带血中分离并体外扩增了大量激活的 NK 细胞，根据冻存时间长短，将脐带血分为三个组别：长期组（深低温冻存 1 - 10 年）、短期组（深低温冻存小于 1 年）、未冻存组（未经冻存的脐带血），然后观察这些 NK 细胞杀伤乳腺癌细胞的作用及其扩增潜力和抗肿瘤效应功能。
此外，扩增的 CB - NK 细胞显示出对来自三阴性乳腺癌和雌激素受体阳性 / 孕激素受体阳性乳腺癌患者的原发性乳腺癌细胞的细胞毒性。
研究表明，长期冷冻保存对扩增的脐带血来源 NK 细胞的扩增潜力或效应功能没有影响，长期冷冻保存的 CB 在临床上仍然可用于治疗性 NK 细胞的离体扩增。
三、总结
肿瘤免疫细胞治疗正迅速发展，未来免疫细胞的用途将越来越广泛，健康的免疫细胞是培养扩增的必要条件，因此来源不断拓宽，不仅局限于外周血，脐带血中同样含有丰富的免疫细胞。
脐带血 NK 细胞来源广、易采集、免疫原性低、组织相容性好，细胞较原始状态，增殖能力更强，靶向杀伤癌细胞的效率也更高。
脐带血来源的 NK 细胞收集和冷冻保存更加便捷，长期冷冻保存对脐带血 NK 细胞的扩增潜能和抗肿瘤活性均无影响。而外周血 NK 细胞在短期（12 周内）冻存无影响，局限性较大。
患者可灵活选择在合适时间内复苏 NK 细胞进行回输，保障患者的疗效，为肿瘤患者争取更多的免疫细胞治疗机会。